28/04/2017
MỘT SỐ NGUYÊN TẮC, KỸ THUẬT, ỨNG DỤNG TRONG NUÔI CẤY MÔ
Nuôi cấy mô thực vật là một trong những ứng dụng đạt được nhiều thành công nổi bật
của công nghệ sinh học thực vật. Với những thuận lợi cơ bản sau:
- Nhân giống nhanh với số lượng lớn.
- Có thể tiến hành ở một số loài thực vật mà biện pháp nhân giống thông thường không
thể thực hiện được.
- Tạo ra cây giống sạch bệnh và tương đối đồng đều về mặt di truyền.
- Có thể sản xuất ra cây giống quanh năm.
- Có thể sử dụng cây nhân giống từ phương pháp nuôi cấy mô để làm cây mẹ cho các
bước nhân tiếp theo.
- Hiệu quả kinh tế cao, đối với người mua cây cấy mô về sản xuất kinh doanh nhanh thu
hồi vốn
Bên cạnh đó, nuôi cấy mô cũng có những mặt hạn chế như chi phí đầu tư cao, cần có kỹ
thuật cao..., một sô loài cây trồng rất dễ gây biến dị khi nhân giống bằng phương pháp cấy
mô.
Các giai đoạn trong nhân giống cấy mô:
Giai đoạn 0: Chuẩn bị cây mẹ
Giai đoạn 1: Bắt đầu tiệt trùng mẫu cấy
Giai đoạn 2: Nhân chuyền
Giai đoạn 3: - Kéo dài
- Tạo rễ và tiền thuần dưỡng
Giai đoạn 4: Thuần dưỡng
1. Cây mẹ và mẫu cấy:
a. Cây mẹ: Cây lấy mẫu muốn đạt được kết quả tốt cần lưu ý các điều kiện sau:
- Chế độ dinh dưỡng của cây mẹ: cây phải sinh trưởng và phát triển tốt.
- Cây mẹ phải bảo đảm sạch bệnh.
- Vị trí lấy mẫu trên cây: Mẫu được lấy ở phần trên mặt đất thì dễ đạt hơn.
- Thời gian lấy mẫu.
b. Mẫu cấy: Tỷ lệ thành công của công đoạn vô trùng mẫu cấy phụ thuộc các yếu tố sau:
- Tình trạng sinh lý của mẫu cấy ban đầu rất quan trọng, những mô trưởng thành tốt
hơn mô già cõi, nếu mẫu cấy là chồi thì phải đủ độ thành thục (chồi bánh tẻ).
- Mô bên trong ít nhiễm hơn bên ngoài. Ví dụ như mầm bên trong, bầu, hạt... Mô bên
trên mặt đất ít nhiễm hơn mô dưới mặt đất.
- Những mẫu kích thước nhỏ thì ít nhiễm hơn mẫu lớn, nhưng khả năng sống sót kém
hơn.
2. Sự vô trùng:
Trong nuôi cấy mô, tiệt trùng mẫu cấy là rất quan trọng nhằm đảm bảo mẫu cấy không bị
nhiễm khuẩn, thông thường sử dụng các phương pháp nhiệt, lọc, hoá chất ...
Hoá chất
Nồng độ áp dụng
Thời gian áp dụng (phút)
Calci hypochlorite
9-10%
5-30
Nước Javel hoặc Clorox (NaOCl)
2% của dung dịch tẩy rửa (20% NaOCl)
5-30
Nước Brom
1-2%
2-10
H2O2
10-20%
5-15
AgNO3
1%
5-30
HgCl2
0.1-1%
2-10
Kháng sinh
400-500 mg/l
30-60
3. Một số vấn đề phát sinh trong khử trùng bề mặt mẫu cấy:
- Virus: là tác nhân gây hại nguy hiễm trong nông nghiệp. Một mẫu cấy nhiễm virus có
thể tạo ra vô số cây con nhiễm. Vì vậy để tạo cây giống không nhiễm virus thì mẫu cấy ban
đầu phải đảm bảo không bị nhiễm virus. Để đảm bảo loại bỏ virus có thể dùng phương
pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng kết hợp với nhiệt trị, hoá trị hoặc vi ghép.
- Vi khuẩn: nhiễm do vi khuẩn thường gặp trong nuôi cấy mô. Vi khhuẩn có thể sống tự
do trong không khí. Sự hiện diện của chúng trong môi trường nuôi cấy gây nhiều bất lợi,
có thể gây chết cây hoặc làm chậm sinh trưởng của mẫu nuôi cấy.
Trong thực tế, việc quản lý mẫu cấy và môi trường nuôi cấy vô trùng là rất khó khăn. Đôi
khi triệu chứng nhiễm xuất hiện chậm trong môi trường nuôi cấy hoặc sau vài lần cấy
chuyền. Các vi khuẩn gây nhiễm thường gặp trong quá trình nuôi cấy là Agrobacterium,
Bacillus, Pseudomonas, Lactobacillus, Staphylococus. Biện pháp khắc phục phổ biến là
cấy đỉnh sinh trưởng hoặc dùng kháng sinh.
- Nấm: rất dễ nhiễm trong quá trình nuôi cấy làm hạn chế sự phát triển của mẫu cấy, làm
chết mẫu cấy. Nhiều loại nấm thường gặp trong nuôi cấy mô là Aspergillus, Candida, Microsprium, Phialopora. Sự nhiễm nấm thường dễ phát hiện sau 1 đến 2 tuần cấy mẫu, nguyên nhân
gây nhiễm là do khử trùng bề mặt mẫu cấy chưa sạch hoặc hoá chất khử trùng chưa thích
hợp, nhiễm do thao tác cấy chuyền hoặc bởi côn trùng nhỏ...
4. Hiện tượng thừa nước
Hiện tượng thừa nước được biểu hiện như lóng ngắn hơn cây bình thường, mộng nước,
giòn, dễ gẫy, màu sắc bất thường, chủ yếu do:
- Mẫu cấy: tuỳ loài giống, độ dài thời gian cấy chuyền, số lần cấy chuyền, cách đặt mẫu
cấy trên môi trường.
- Môi ttrường: loại và nồng độ agar, nồng độ của khoáng, loại và nồng độ auxin.
- Bình chứa quyết định thành phần và nồng độ khí.
H1: Hiện tượng thừa nước ở lan Dendrobium
- Môi trường bên trong (vi khí hậu): nhiệt độ, cường độ và phẩm chất ánh sáng, ẩm độ
tương đối, sự di chuyển của không khí.
* Cách khắc phục:
+ Tăng nồng độ agar, sử dụng cytokinin ở nồng độ thấp, giảm nồng độ ion amonium và
vi lượng trong môi trường.
+ Bình chứa có màng thông khí hoặc plactic thấm khí để gia tăng sự trao đỗi khí.
+ Tăng cường độ ánh sáng ở môi trường xung quanh.
5. Sự hoá nâu
Mẫu cấy và môi trường thường trở nên nâu hoặc đen sau khi cấy, sau một thời gian mô
thường chết. Sự sinh trưởng bị ảnh hưởng nặng ở những loài có nồng độ tanin cao hoặc
các hợp chất phenol như lan Hồ điệp...
H2: Sự hoá nâu ở Hồng H3: Sự hoá nâu ở Mokara
* Cách khắc phục sự hoá nâu:
- Để các mẫu đã cấy vào trong tối hoặc nơi ánh sáng ít hơn.
- Cấy chuyền nhiều lần, có thêm chất oxy hoá vào môi trường nuôi cấy.
- Ngâm trong nước máy hoặc trong các chất oxy hoá như Acid ascorbic (Vitamin C); acid
citric...Sau khi khử trùng mẫu cấy có thể ngâm trong nước cất đã khử trùng 1-2 giờ tuỳ đặc
tính của mô cấy.
6. Sự thuần dưỡng:
Cây được nuôi trong phòng đến khi hoàn chỉnh thì cho ra ngoài thuần dưỡng thành cây
con thành thục ở ngoài môi trường tự nhiên thích hợp.
Điều kiện trong keo
Điều kiện bên ngoài nhà lưới
Nhiệt độ: 26 ± 20C
Ẩm độ: Tương đương 100%
Cường độ ánh sáng: 1000 lux
Nhiệt độ: 29 - 340C
Ẩm độ: Tương đương 67-75%
Cường độ ánh sáng: 3000-4000
lux
Cấu trúc hình thái và giải phẩu của cây cấy mô có một số khác biệt so với cây con trồng trong
nhà lưới:
- Lớp cutin: do ẩm độ trong bình nuôi cấy cao nên sự thiếu lớp sáp dày trên bề mặt lá
là một trong những nguyên nhân làm cho cây cấy mô dễ mất nước và dễ chết trong điều kiện
tự nhiên.
- Khí khẩu: ở cây cấy mô thì khí khẩu có dạng tròn so với bình thường cây trồng trong nhà
lưới có cấu trúc hình elip. Mặt khác, cây cấy mô có số khí khẩu trên đơn vị diện tích lá nhiều
hơn cây trồng trong nhà lưới. Khí khẩu của cây cấy mô chưa có chức năng đóng mở, khi
chuyển từ bình nuôi cấy ra môi trường bên ngoài hầu hết khí khẩu đều mở. Vì vậy, trong
những ngày đầu khi chuyển cây cấy mô ra môi trường ngoài sự mất nước của cây rất cao.
- Lá của cây cấy mô mỏng hơn lá của cây trồng trong nhà lưới.
- Thân của cây cấy mô thiếu mô giữa và cương mô là những mô hỗ trợ cho sự cứng
chắc của thân. Vì vậy, cây cấy mô thường yếu hơn cây trồng trong nhà lưới.
- Rễ của cây cấy mô thường chưa có chức năng như một số loài, rễ chưa phát triển
lông hút, chưa hoàn chỉnh sự liên kết giữa hệ mạch rễ và thân.
7. Một số ứng dụng nổi bật:
Ứng dụng nuôi cấy mô trong giai đoạn hiện nay để nhân nhanh cây giống là rất cần thiết,
nhất là đối với những giống cây khó nhân nhanh bằng biện pháp thông thường hoặc cần sản
xuất ra hàng loạt theo nhu cầu thị trường.
H4: Phòng nuôi cấy mô trại giống Tân Khánh Đông
Tuy nhiên nếu sản xuất ra số lượng nhiều mà không có người mua thì không có hiệu quả.
Do đó thường thì cơ sở nuôi cấy mô sản xuất theo đơn đặt hàng trước.
( Nguồn internet)
